产品货号：
YTB4068
中文名称：
一步法荧光定量RT-PCR试剂盒(SYBR Green)
英文名称：
ByFast SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit
产品规格：
100T|500T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒是一种基于SYBR Green染料用于一步法反转录实时荧光定量PCR，即qRT-PCR或real-time RT-PCR的高品质预混液，主要用于RNA的特异性超高灵敏度定量检测。
本试剂盒以提取的RNA为模版，使用qPCR引物在同一反应管内连续进行反转录和荧光定量PCR，操作简单快速，最大限度地减少人为误差，有效降低污染风险，节约PCR实验的操作时间，检测通量大。
本试剂盒整合了高效的BalbRT M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor和优异的抗体结合型热启动ByFast Taq DNA Polymerase，并优化了缓冲体系，反转录性能优、检测灵敏度高、扩增特异性强、反应稳定性好，非常适合于內源低丰度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的检测。
本试剂盒使用SYBR Green I作为染料。SYBR Green I是一种结合于双链DNA(double-strand DNA,dsDNA)双螺旋小沟区域的绿色荧光染料。SYBR Green I在游离状态下的荧光比较微弱，一旦与双链DNA结合后，其荧光会大大增强。这样通过检测荧光强弱就可以定量检测PCR过程中扩增产生的双链DNA的数量。
本试剂盒使用的ByFast Taq DNA Polymerase是一种与抗体结合的高品质热启动酶，能够实现便捷高效的热启动。ByFast Taq DNA Polymerase中的Taq酶与抗Taq酶的单克隆抗体相互结合，从而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，这样可以有效避免在低温条件下由引物和模板DNA非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。在PCR反应的预变性步骤中抗体会被加热失活，这样可以确保仅在预变性后才会把Taq酶的活性释放出来，预变性之前不会发生DNA聚合反应，从而大大提高了PCR反应的特异性、灵敏度和定量检测的准确性。
本试剂盒包含了BalbRT M-MuLV Reverse Transcriptase、ByFast Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、SYBR Green I荧光染料、稳定剂、Nuclease-free Water、ROX (根据不同荧光定量PCR仪进行选择)和镁离子等所有的通用组分，使操作更简单、使用更便捷。用户只需自备引物和样品RNA即可。
| 组分 | 100T | 500T |
| 10×SYBR Green One-Step Enzyme Mix | 200μL | 1mL |
| 2×SYBR Green One-Step Reaction Buffer | 1mL | 5mL |
| Nuclease-free Water | 1mL | 5mL |
| 50×Low ROX | 40μL | 200μL |
| 50×High ROX | 40μL | 200μL |
| 说明书 | 1份 | 1份 |
保存：-20℃避光，尽量避免反复冻融，有效期2年。
如果用于常规的96孔板qRT-PCR检测(建议反应体系为20μL)，100T可以进行100次检测，500T可进行500次检测；如果用于常规的384孔板qRT-PCR检测(建议反应体系为10μL)，100T可以进行200次检测，500T可进行1000次检测。
本试剂盒提供了Low ROX和High ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。
| ROX | 适用PCR仪 |
| 不需添加 | Bio-Rad:CFX384,CFX96,MiniOpticon,iCycler IQ,MyiQ and iQ5; Eppendorf:Mastercycler ep realplex and realplex2 s; Qiagen/Corbett Rotor-Gene:6000; Roche LightCycler 480;Cepheid SmartCycler;Illumina Eco qPCR |
| Low ROX | ABI:7500(Fast),ViiA 7,QuantStudio 6 and 7 Flex Systems; Stratagene:Mx3000P,Mx3005P and Mx4000; Qiagen/Corbett Rotor-Gene:3000; Bio-Rad/MJ:Chromo4,Opticon 2 and Opticon; |
| High ROX | ABI GeneAmp 5700;ABI PRISM 7000,7700;ABI 7300,7900HT(Fast);ABI StepOne(Plus) |
- 请注意避免RNase污染，使用RNase-free的枪头、离心管等。
- 10×SYBR Green One-Step Enzyme Mix含有高浓度甘油，粘度高，使用前将短暂离心至管底，并用移液器轻轻混匀，混匀过程中尽量避免产生气泡，然后缓慢准确吸取。
- 使用前需确保2×SYBR Green One-Step Reaction Buffer完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。
- 如果扩增片段较长或者RNA结构较为复杂，可将模板RNA在65℃预处理5～10分钟，可提高反转录效率。
- 本反应使用qPCR的Reverse Primer作为反转录的基因特异性引物，不能使用Random Hexamer Primer或Oligo(dT) Primer等常用于cDNA第一链合成的引物。
- 注意引物退火温度，当退火温度<60℃时，推荐使用三步法PCR扩增。
- 本产品中含有SYBR Green I荧光染料，保存本产品或设置PCR反应时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。
- 对于超过350bp或者高GC含量的扩增片段，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。
- 经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响。但仍需尽量避免反复冻融本产品，反复冻融可能使产品性能下降。
- qPCR检测是超高灵敏度的检测，PCR反应设置区域需尽量避免各种可能的待扩增产物的污染。PCR产物宜密封后丢弃，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。
- One-Step qRT-PCR反应体系的设置：
- 融解并混匀One-Step qRT-PCR反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。
- 参考下表在室温或冰浴上设置One-Step qRT-PCR反应体系(以96孔板，每孔反应体系为20μL为例)：
成分 用量 终浓度 2×SYBR Green One-Step Reaction Buffer 10μL 1× 10×SYBR Green One-Step Enzyme Mix 2μL 1× Forward and Reverse Primer Mix (3μM each) 2μL 300nM Template RNA 2μL 1pg～2μg 50×ROX 0.4μL/- 1×/- RNase-Free Water Up to 20μL -
注意：- 当检测样品比较多时，可根据样品数量先配制所需的相同试剂的混合液，一般多配制5～10%，然后再分装到每个反应孔中，最后再在每个反应孔中加入不同的试剂，这样可使所取的试剂体积更准确更均一，误差更小，并减少试剂损失。例如：检测的目的RNA相同，而RNA样品不同，则可以把除RNA样品外的所有试剂根据样品数量配制在一起，然后分液至每个反应孔中，最后再加入不同的模板RNA。
- 通常引物的终浓度为0.2～0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况在0.1～1.0μM范围内调整引物的终浓度。
- 通常RNA模板的量以1pg～2μg为参考用量，一般总RNA为100ng～1μg。因不同物种的模板中含有RNA的拷贝数不同，如有必要，可对模板RNA进行梯度稀释，以确定最佳的模板RNA使用量。同时，由于qPCR灵敏度极高，建立反应体系时加入RNA模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响，因此建议将模板RNA适当稀释后加入反应体系中，比如每个20μL反应体系2～5μL，这样可以有效提高实验的重复性。
- 不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。
- 96孔板的推荐反应体系为20μL，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。
- 建议设置不加模板RNA的阴性对照组。
- 当检测样品比较多时，可根据样品数量先配制所需的相同试剂的混合液，一般多配制5～10%，然后再分装到每个反应孔中，最后再在每个反应孔中加入不同的试剂，这样可使所取的试剂体积更准确更均一，误差更小，并减少试剂损失。例如：检测的目的RNA相同，而RNA样品不同，则可以把除RNA样品外的所有试剂根据样品数量配制在一起，然后分液至每个反应孔中，最后再加入不同的模板RNA。
- 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
- 将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。
- 融解并混匀One-Step qRT-PCR反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。
- One-Step qRT-PCR反应程序：
50℃ 15分钟一般可以得到理想的反转录效果，但如果片段较长，也可以增加至30分钟。在Real-time PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃ 2分钟，复杂或高GC模板适当延长时间至5分钟。本产品中的ByFast Taq DNA Polymerase可以在15秒内可完成至少300bp的扩增，可以满足绝大多数的qPCR实验；对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。建议采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT荧光定量PCR仪为例：- 反应程序如下
过程 温度 时间 循环数 反转录 50℃ 15～30min 1 预变性 95℃ 2min 1 变性 95℃ 15sec 40 退火/延伸 60℃ 15～30sec - 熔解曲线分析(可选)：95℃ 15sec,60℃ 15sec,95℃ 15sec
- 使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果
三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，仍然设置40个循环即可。
注：以上举例为常规qPCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件，并根据比例放大或缩小反应体系。 - 反应程序如下
- 荧光定量PCR结果不理想，出现特异性不好或扩增效率不高时，可能原因如下：
- 样品RNA发生降解。此时可以通过RNA电泳等方法确认所使用的RNA样品是否发生明显的降解，在反转录实验前的实验操作过程中需要严格注意无RNA酶的实验操作。
- 引物设计不佳。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。也可以尝试使用有文献报道使用过的引物，或者从百奥莱博订购经过测试的qPCR引物。
- 待扩增片段GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时宜更换引物。
- PCR反应体系在室温设置时容易导致非特异性条带，但在使用热启动酶时可以有效避免室温操作导致的非特异性条带的产生。但对于一些较难扩增的产物，可以尝试在冰浴上设置PCR反应体系，以进一步减少非特异性的DNA扩增。
- 退火温度不佳，需要优化。这种情况下宜更换引物。
- 待扩增片段GC含量较高或长度较长，变性不够充分。此时宜更换引物，使待扩增片段的GC含量和长度适中。
- 模板量太低，此时宜适当加大模板量。
- 模板中含有抑制PCR反应的物质，可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。
- 样品RNA发生降解。此时可以通过RNA电泳等方法确认所使用的RNA样品是否发生明显的降解，在反转录实验前的实验操作过程中需要严格注意无RNA酶的实验操作。
- 反应条件优化方法：
- 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM时可获得良好检测效果，终浓度可以在0.1～1.0μM范围内适当调整。如果希望提高反应特异性，可降低引物浓度；如果希望提高扩增效率，可增加引物的浓度，从而优化反应体系。
- 退火温度：建议采用两步法PCR，退火温度60℃进行反应。如果希望提高反应特异性，可提高退火温度，以60～64℃作为退火温度的调整范围。在引物Tm值较低而得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，三步法的退火温度请以56～64℃作为温度设置的参考范围。
- 延伸时间：建议采用两步法PCR，延伸15～30秒。对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。
- 引物浓度：通常引物终浓度为0.2μM时可获得良好检测效果，终浓度可以在0.1～1.0μM范围内适当调整。如果希望提高反应特异性，可降低引物浓度；如果希望提高扩增效率，可增加引物的浓度，从而优化反应体系。
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